به حجم کل میکروتیوب به میزان ۳۰۰ میکرو لیتر از محلول TES اضافه و مخلوط می کنیم.
۱۸ میکرولیتر از SDSبه آن اضافه و مخلوط می کنیم. سپسµl3 آنزیم پروتئیناز K اضافه می نمائیم.
به مدت ۲ ساعت یا یک شبانه روز نمونه را در بن ماری۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه می نمائیم.
پس از اتمام انکوباسیون، ۲۲۰ میکرولیتر از محلول نمک اشباع اضافه و ۵ دقیقه سانتریفوژ(rpm 12000) می کنیم.
محلول رویی را جدا می کنیم و به آن ۵۵۰ میکرو لیتر ایزوپروپانل می افزائیم. پس از دیدن کلاف DNA آن را جدا می کنیم و مراحل شستشو با اتانل ۷۰ درصد را انجام می دهیم. پس از تبخیر الکل به مقدار کافی به آن بافر TE می افزائیم و اجازه می دهیم تا DNA هیدراته شود.
۳-۷-۳ آنالیز پیوستگی برای بررسی ۷ جایگاه ژنی مرتبط با ناشنوایی اتوزومی مغلوب غیرسندرمی
در این تحقیق، ابتدا با بهره گرفتن از روش غیر مستقیم آنالیز پیوستگی[۵۴]، امکان پیوسته شدن هر یک از
این جایگاه های ژنی با مارکرهای STR را بررسی کردیم. در صورت پیوسته شدن هر یک از این جایگاه های ژنی با مارکرهای STR، این نمونه ها جهت تائید وجود جهش و همچنین تعیین نوع و جایگاه آن با بهره گرفتن از روش توالی یابی[۵۵] مورد بررسی قرار می گیرند.
انتخاب مارکرهای مناسب برای هر جایگاه ژنی است که توسط روش های بیوانفورماتیکی صورت می گیرد اولین مرحله است.
۳-۷-۳-۱ انتخاب مارکرهای STR
جهت انجام آنالیز پیوستگی برای هر کدام از این جایگاه ها، حداقل سه مارکر STR انتخاب شد. از آنجائیکه جایگاه های ژنی مورد بررسی در این تحقیق همگی دارای ژنهای شناخته شده هستند، در هنگام انتخاب مارکرها سعی بر این شد که نزدیک ترین مارکرها به ژن در جایگاه ژنی مربوطه جستجو و انتخاب گردد. از این رو جهت جستجوی مارکرهای STRمناسب تر، از وب سایت بیوانفورماتیکی UCSC Genome Browser استفاده شد که طی آن ترتیب مارکرها نسبت به ژن و جایگاه ژنی موردنظر با استفاده نقشه توالی در این وب سایت به دست آمد. فاصله فیزیکی هر کدام از مارکرها (بر اساس جفت باز) به طور دقیق در وب سایت UCSC Genome Browser مشخص و سپس با بهره گرفتن از پایگاه اطلاعاتی NCBI (UNISTS) تائید دوباره شد[۸۳,۸۴] .
براساس اطلاعات ذکر شده در این سایت های اطلاعاتی و همچنین پایگاه اطلاعاتی ژنوم میزان هتروزیگوتی مارکرها در جمعیت‌های مختلف و تعداد تکرارهای هر کدام از آنها تعیین شد. تکرارهای تترانوکلئوتیدی کمتر از تکرارهای دی نوکلئوتیدی شایع هستند، اما به عنوان مارکرهای ژنتیکی بسیار مفیدتر از آنها می‌باشند، زیرا قطعات تکثیر شده توسط PCR شامل تکرارهای تترانوکلئوتیدی در مقایسه با تکرارهای دی نوکلئوتیدی بهتر در ژل الکتروفورز باز می شوند.
سپس با مقایسه فاصله فیزیکی مارکرها، نزدیک ترین مارکرها به ژن مورد نظر انتخاب شد. نکات دیگری که در انتخاب مارکرها در نظر گرفته شد تعداد تکرارهای آنها و همچنین فرکانس آللی آنها بود. مارکرهایی که حتی الامکان دارای تکرارهای ۴ تایی و بعد ۳ تایی و بعد ۲ تایی بودند و همچنین فرکانس آللی بالایی در جمعیت های دیگر انتخاب شد، به خصوص جمعیت هایی که با ساختار مشابه با جمعیت ایران بودند.
در مرحله آخر، توالی پرایمرهای مربوط به آنها جهت تکثیر از سایت های بیوانفورماتیکی تهیه گردید. لیست تمامی مارکرهای سفارش داده شده برای هر جایگاه به همراه شکل شماتیکی از چگونگی قرار گیری آنها ارائه می شود.
۳-۷-۳-۱-۱ ژن GJB4
جدول ۳-۳ مارکر های ژن GJB4
| MARKER | ANNEALING TEMP. ˚C | DISTANCE (bp) |
REPEATS |
| D1S1570 | ۵۰ | ۱۵۸-۱۷۴ | di |
| D1S496 | ۵۵ | ۲۱۳-۲۳۹ | di |
| D1S195 | ۵۶ | ۱۸۳-۱۸۹ | di |
شکل ۳-۱ موقعیت مارکرهای ژن GJB4
