شکل۱-۱ پروتئین CD166 و دمین های آن )اولریچ والده و همکاران،۲۰۱۰)
ALCAM قادر است که واکنش متقابل هموفیلیک را همانند هتروفیلیک به کار اندازد. ژن انسانی برای ALCAM روی کروموزم ۳ قرار گرفته است(۳q33، ۱q132) و از ۱۶ exon تشکیل شده است که دارای اندازه ای بیش از kb 200 است. ALCAM یک نوع مولکول غشایی تیپ ۱ است و دارای ۵۰۰ اسید آمینه در ناحیه خارج سلول و ۲۲ اسید آمینه در ناحیه گذرنده از غشا ، ۳۴ اسید آمینه در ناحیه سیتوپلاسمیک و وزن مولکولی KD_a ۱۰۵ است. روش های مختلف ژنومیکس و پروتئومیکس مختلف اشاره کرده اند که ALCAM به عنوان هدف مرتبط با آنکولوژی است..جمع بندی های مشابه از ترکیب علامت گذاری، تفکیک پذیری بالا با بهره گرفتن از ژل دو بعدی الکتروفوز و آنالیز اسپکترومتریک توده پروتئین های بیان شده روی سطح سلولهای نرمال و سلولهای سرطلانی بدخیم انجام شده بودند و ALCAM را به عنوان پروتئین بیان شده مختلف و یک مارکر پروتئینی جدید برای بازدارندگی بیماری معرفی می کنند. ALCAM توسط گروه های مختلف به عنوان یک انتی ژن شناسایی شده است که توسط سلول های بنیادی سرطان روده معرفی شده است.

همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،۲۰۱۳)کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایز یافته یا درحال تمایز را که قسمت عمده ی توده تومور را شکل می دهند هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و  قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالی که جمعیت سلول های سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عود کردن بیماری می شوند.برخی محققان بر این باورند که در مرکز هر توموری تعداد کمی سلول های بنیادی نابهنجار قرار گرفته اند که رشد بافت های بدخیم و ناهنجار را تداوم می بخشند.اگر این نظر درست باشد، می تواند توضیح دهد که چرا تومورها اغلب حتی پس از اینکه به وسیله داروهای ضد سرطان تقریباً تخریب شده اند دوباره بازسازی می شوند. این حالت همچنین یک راهکار متفاوت برای ایجاد داروهای ضد سرطان را نشان می دهد و دال بر آن است که این داروها می بایستی برای از بین بردن سلول های بنیادی سرطانی و نه برای توانایی شان در از بین بردن هر سلولی و کوچک کردن تومورها، انتخاب شوند.
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از ۹۰% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ می دهند .تومورهای اولیه می توانند توسط جراحی یا درمان های مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطان هایی که به مرحله متاستاز رسیده اندبه درمان مقاوم اند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ رادرمیان افراد دارای متاستاز نشان می دهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایند های ایجادکننده متا ستاز وفراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن می باشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،۱۳۹۱).هم چنین یکی از معظلات اسا سی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز ان به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.
شکل۱-۴ رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیایی Cd166 در ضایعات اولیه سرطان کولورکتال-A بیان قوی CD166-B بیان ضعیف CD166 (مایکل تاچزی و همکاران،۲۰۱۲)
۱-۳ مساله تحقیق
ALCAM یک عضو از خانواده ایمنو گلوبولین ها است .ALCAM قادر است که واکنش متقابل هموفیلیک را همانند هتروفیلیک به کار اندازد. ژن انسانی برای ALCAM روی کروموزم ۳ قرار گرفته است(۳q33، ۱q132) و از ۱۶ exon تشکیل شده است که دارای اندازه ای بیش از kb 200 است. ALCAM یک نوع مولکول غشایی تیپ ۱ است و دارای ۵۰۰ اسید آمینه در ناحیه خارج سلول و ۲۲ اسید آمینه در ناحیه گذرنده از غشا ، ۳۴ اسید آمینه در ناحیه سیتوپلاسمیک و یک ناحیه مولکولی KD_a ۱۰۵ است. روش های مختلف ژنومیکس و پروتئومیکس مختلف اشاره کرده اند که ALCAM به عنوان هدف مرتبط با آنکولوژی است..جمع بندی های مشابه از ترکیب علامت گذاری، تفکیک پذیری بالا با بهره گرفتن از ژل دو بعدی الکتروفوز و آنالیز اسپکترومتریک توده پروتئین های بیان شده روی سطح سلولهای نرمال و سلولهای سرطلانی بدخیم انجام شده بودند و ALCAM را به عنوان پروتئین بیان شده مختلف و یک مارکر پروتئینی جدید برای بازدارندگی بیماری معرفی می کنند… ALCAM توسط گروه های مختلف به عنوان یک انتی ژن شناسایی شده است که توسط سلول های بنیادی سرطان روده معرفی شده است.
همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،۲۰۱۳)کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایز یافته یا درحال تمایز را که قسمت عمده ی توده تومور را شکل می دهند هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و  قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالی که جمعیت سلول های سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عود کردن بیماری می شوند.برخی محققان بر این باورند که در مرکز هر توموری تعداد کمی سلول های بنیادی نابهنجار قرار گرفته اند که رشد بافت های بدخیم و ناهنجار را تداوم می بخشند.اگر این نظر درست باشد، می تواند توضیح دهد که چرا تومورها اغلب حتی پس از اینکه به وسیله داروهای ضد سرطان تقریباً تخریب شده اند دوباره بازسازی می شوند. این حالت همچنین یک راهکار متفاوت برای ایجاد داروهای ضد سرطان را نشان می دهد و دال بر آن است که این داروها می بایستی برای از بین بردن سلول های بنیادی سرطانی و نه برای توانایی شان در از بین بردن هر سلولی و کوچک کردن تومورها، انتخاب شوند.
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از ۹۰% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ می دهند .تومورهای اولیه می توانند توسط جراحی یا درمان های مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطان هایی که به مرحله متاستاز رسیده اندبه درمان مقاوم اند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ رادرمیان افراد دارای متاستاز نشان می دهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایند های ایجادکننده متا ستاز وفراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن می باشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،۱۳۹۱).هم چنین یکی از معظلات اسا سی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز ان به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.
در این مطالعه ما در نظر داریم با آنالیز بیوانفورماتیکی ، کلونینگ و بیان پروتئین سطحی CD166 ، پتانسیل موجود برای بهبود روش های تشخیص مثل تولید کیت های تشخیصی جهت تشخیص زودهنگام و پیش از بدخیم شدن سلول های سرطانی کولورکتال و همچنین گشایشی در تولید واکسن علیه سرطان کولورکتال را بررسی کنیم. در این مطالعه فرضیه های زیر مطرح شد.
توالی مورد نظر را می توان از طریق نرم افزارهای بیوانفورماتیکی بهینه کرد.
مولکول سنتز شده می تواند در میزبان مناسب کولون و بیان شود.
فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده
۲-۱ ۱۶۶ CD در درمان سرطان
افزایش دلایل و شواهد مبنی بر اینکه انواع سرطان ها ناشی از جمعیت های کوچک سلول های بنیادی سرطان^[۱۵] () بوده که در شیمی درمانی های متداول می توانند زنده بمانند و قادر به بازسازی تومور اصلی می باشند ، توسعه درمان های جدید را که CSC را هدف قرار داده تسریع می کند . سلول های CRC ^[۱۶] نشان دهنده مارکرهای CSC شناخته شده ، ضمن بررسی با داروهای شیمیایی درمانی در محیط آزمایشگاه ، ماندگاری بیشتر یا قابلیت رشد بیشتر تومور در بافت زنده را نشان نمی دهند . ( مانوئل گیوسپه^[۱۷] و همکاران ،۲۰۱۲ ، سالمون اوفوری و جودی کینگ^[۱۸]،۲۰۰۸، یوسوکه شینوزاوا و همکاران،۲۰۱۳؛ محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،۱۳۹۱)
این پروتئین در تعامل سلول- سلول از نوع هموفیلیک و هتروفیلیک نقش دارد.در نوع هموفیلیک واکنش می دهد .(اولریچ CD6) و در تعامل هتروفیلیک با ALCAM-ALCAM با خودش (
وایدله و همکاران،۲۰۱۰؛ اریک اندرسون و همکاران^[۱۹]،۲۰۱۱؛کاترینا فانالی و همکاران^[۲۰] ،۲۰۱۴)
مولکول فعال چسبند به لکوسیت( CD166 و ALCAM ) بر اساس گزارش های تحقیقاتی در رشد سرطان کولورتال (CRC) و فعالیت خاص آن به عنوان نشانه سلول پایه سرطان ، مورد توجه می باشد. (ویچرت و همکاران^[۲۱]،۲۰۰۴)
در دو نوع تعامل سلول –سلول هموفیلیک ^[۲۲]و ALCAMاین نکته مشخص گردیده است که
هتروفیلیک^[۲۳] به عنوان میانجی عمل می کند.. مشخص شده گلیکوزیلاسیون^[۲۴] پس از ترجمه هیچ اثری بروی خاصیت اتصالی هموفیلیک ندارد.(گیادو اسوارت^[۲۵]،۲۰۰۲)
ALCAM در بیماران مبتلا به CRC ظاهر می شود و می توان از آن به عنوان شاخص تشخیصی استفاده کرد. ALCAM در بیشتر زخم های اولیه (۷۶ درصد) و ثانویه (۶۲ درصد) CRC ظاهر می شود. ظاهر شدن بیشتر آن در تومورهای متمایز ، بیشتر نشان دهنده نقش احتمالی آن در مراحل اولیه رشد تومور بوده و کاهش آن با چسبندگی سلولی کمتر و در نتیجه پتانسیل بیشتر متاستاژ تومور همراه است . ( تاچزی^[۲۶] و همکاران ،۲۰۱۲)
میانگین نسبت ظاهر شدن ۱۶۶ CD (ALCAM) در سرطان کولورتال به لحاظ ایمونولیستوشیمیایی ۵۶ درصد می باشد . به طور خاص در سرطان کولورتال نتایج نشان دهنده ظاهر شدن (۱۶۶ CD مثبت به عنوان شاخص مستقل با ایجاد تومور کوچکتر بوده که با این حال در نزدیکی غدد لنفاوی به شدت گسترش یافته اند . بر اساس بررسی های منتشر شده ، موقعیت های سلولی مختلف ۱۶۶ CD (ALCAM ) از ارزش تشخیص قابل توجهی برخوردار است. (چائونی ^[۲۷]و همکاران ،۲۰۱۳)
متاستاز و عود مجدد سرطان کولورکتال بعد از درمان به سلول های بنیادی مربوط می شود. از سال ۲۰۰۶ تا ۲۰۱۲ ، نمونه های کولکتومی^[۲۸] ( برداشتن تمام یا بخشی از روده بزرگ ) بیماران مبتلا به سرطان روده که در دانشگاه علوم پزشکی بابل در ایران انجام شده بود بررسی شدند . نتایج نشان داد که بیان ۱۶۶ CD در بیشتر از دو سوم بیماران دیده می شود . ۱۶۶ CD هم می تواند بیان سیتوپلاسمی داشته باشد هم می تواند بیان غشایی . بیان غشایی شاخص ۱۶۶ CD در سرطان کولورکتال بیشتر مربوط به راست روده می شود. (شافعی^[۲۹] و همکاران ، ۲۰۱۳)
۱۶۶ CD که به عنوان مولکول چسبندگی سلول لوکوسیت فعال شده (ALCAM) نیز شناخته شده ، توسط انواع سلول ها در چندین بافت ظاهر می شود . با وجود این ، نقش ۱۶۶ CD در سلول های بدخیم به ویژه در سرطان لوزالمعده مورد اختلاف است . روش های ایمونوهیستوشیمی و سیتومتری جریان را جهت آنالیز بیان ۱۶۶ CD در بافت های جراحی شده لوزالمعده در رشته های سلول سرطان لوزالمعده انجام دادند. آنالیزهای کلی RT-PCR و میکروآرایه را نیز جهت ارزیابی سطوح بیان ۱۶۶cD و ژن های مربوطه در سلول های کشت شده انجام دادند . روش ایمونوهیستوشیمی بیان بالای ۱۶۶CD در بافت های سرطان لوزالمعده را در مقایسه با نمونه های کنترل لوزالمعده نرمال را نشان داد . سیتومتری جریان نشان داد که ۱۶۶ CD در ۲/۷۰ -۸/۳۳ درصد سلول ها در بافت های جراحی شده لوزالمعده و ۵/۹۹-۰ درصد رشته های سلولی سرطان لوزالمعده ظاهر شد . سلول های سرطانی لوزالمعده ۱۶۶ CD مثبت شدیدا تومورزا می باشند،در حالی که سلول های سرطانی لوزالمعده ۱۶۶CD منفی فعالیت های تهاجمی و جابجایی نسبتا قوی تری را نشان می دهند . ( فوجی وارا^[۳۰] و همکاران ،۲۰۱۴)
یکی از اهداف شیمی درمانی رساندن داروها در دوزهای مؤثر بصورتی ایمن و اثرگذار به جایگاه های وجود بیماری بدون تأثیر بر بافت های سالم است. برای بهبود انتقال داروها امروزه از نانوتکنولوژی استفاده می شود که عوارض جانبی را کاهش داده ، سمی شدن داروها را به حداقل می رساند و راندمان درمان را بالا می برد. با این حال به دلیل تنوع در ترکیبات کربوهیدراتی موجود در ساختمان آنتی بادی ها که می تواند موجب سمی شدن آنتی بادی شده و خطر استفاده از چنین آنتی بادی هایی را بالا ببرد و همچنین به دلیل این که نیمه ، عمر اکثر آنتی بادی در سرم بسیار کوتاه است ، دانشمندان به فکر استفاده از عامل دیگری به جای آنتی بادی ها افتادند. اپتامرهای RNA ای جایگزین مناسبی به نظر می رسیدند .
امتیاز این مولکول ها ، تولید ارزان تر و استحکام و ماندگاری بالاتر نسبت به آنتی بادی ها است .این اپتامرها بعداز اتصال با پروتئین سطحی از طریق اندوسیتوز وارد سلول می شوند ، بنابراین می توانند به عنوان یک انتقال دهنده داروهای شیمی درمانی ، سم ها و رادیوایزوتوپ های درمانی به کار گرفته شوند ، اما این اپتامرها قادر بودند پروتئین های سطحی شاخص سرطان را در مقیاس خیلی کم را نیز شناسایی کنند. و بافت های طبیعی بدن را نیز مورد هدف قرار دهند . ( لی^[۳۱] و همکاران ،۲۰۱۴) میانگین سن ابتلا به سرطان طی سال های اخیر روندی نزولی داشته است ؛ به طوری که سن متوسط بیماران در سال ۱۳۸۰ حدود ۹/۶۰ سال و در سال ۱۳۸۴ حدود ۳/۵۷ سال بوده است ؛ به طوری که بیشترین سرطان ها در گروه سنی ۷۵-۷۰ سال مشاهده می شود. ( محقق و همکاران ،۲۰۰۸) در سرطان کولورکتال افرادی که در زمان تشخیص بیماری ، دچار متاستاز تومور به سایر ارگان ها بوده اند ، خطر مرگ در آنها ۴ برابر موارد عدم بروز متاستاز است. ( ژو^[۳۲] و همکاران،۲۰۰۶ ،هان^[۳۳] و همکاران ،۲۰۰۶)
بسیاری از پژوهش نشان داده اند که نوعی همبستگی قوی میان وسعت نفوذ تومور به دیواره روده و بقاء بیماران در سرطان کولورکتال وجود دارد. ( ایا^[۳۴] و همکاران ،۲۰۰۳،هی^[۳۵] و همکاران ،۲۰۰۲)
فصل سوم : مواد و روش ها
در انجام این پایان نامه از عوامل زیر استفاده کردیم :
۳-۱-۱ باکتری مورد استفاده
در این پایان نامه در مرحله کلونینگ ژن CD166 از باکتری E.coli سویه TOP10 و در مرحله ی ساب کلونینگ از باکتری E.coli سویه (DE3) BL21 استفاده شد . این باکتری ها ابتدا بصورت لیوفیلزه بودند و برای استفاده از آن ، پودر باکتری را به ۵ میلی لیتر محیط کشت مایع LB اضافه کردیم و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت یک شبانه روز کشت داده شدند.
۳-۱-۲ پلاسمید
در مرحله ی ساب کلونینگ از پلاسمید بیانی (pet-28a) که دارای پارامترهای بیان کننده و همچنین جایگاه های برش آنزیمی دلخواه است استفاده کردیم. این پلاسمید دارای جایگاه های مختلف برای انواع آنزیم های محدود کننده می باشد که می توان ژن موردنظر را به کمک آنها وارد پلاسمید کرد. همچنین دارای ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین است که به باکتری ترانسفورم شده امکان بقاء را در محیط حاوی کانامایسین می دهد. جهت بیان قطعه ژن کلون شده در آن هم دارای پارامترهای بیانی مانند پروموتر lac می باشد که در حضور القاگر IPTG شروع به بیان ژن موردنظر می کند. در شکل ۳-۱ ، نقشه ژنی پلاسمید pet-28a نشان داده شده است.
۳-۱-۳ آنزیم ها
از آنزیم های محدودالاثر (Ncol) و (Xhol) که از شرکت فرمنتاز^[۳۶] لیتوانی تهیه شدند و از آنزیم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ی Ligation استفاده گردید. این آنزیم ها در شرایط دمایی ۲۰ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۳-۱-۴ کیت های آزمایشگاهی
کیت استخراج DNA از ژل و کیت استخراج پلاسمید از شرکت فرمنتاز لیتوانی تهیه شدند و در شرایط دمایی ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۳-۱-۵ آنتی بیوتیک ها
آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین نیز با غلظت مناسب تهیه کردیم و در تیوب های ۵/۱ میلی لیتری تقسیم گردید و در شرایط دمایی ۲۰ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۳-۱-۶ محیط کشت باکتری
در این مطالعه از محیط کشت های LB آگار و محیط کشت آگار جهت تکثیر باکتری استفاده شد.
۳-۱-۷ ژل الکتروفورز
پودر آگارز Low شرکت هیسپانلب^[۳۷] تهیه شد و جهت ساختن ژل الکتروفورز مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۱-۸ مواد شیمیایی
کلیه مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان با درجه ی خلوص بیولوژی مولکولی تهیه گردید و در مراحل مختلف از جمله تولید ژل الکتروفورز (SDS-Page) مورد استفاده قرار گرفت.