کمی
کیفی
زمینه ای
مستقل
وابسته
پیوسته
گسسته
اسمی
رتبه ای
پلی مورفیسم
C-509T
ژن TGF-β۱
*
*
TT
CT
CC
دارد- ندارد
۳-۵ استخراج DNA
استخراج DNA از خون تام با بهره گرفتن از کیت DNG شرکت زیست فناوری کوثر انجام گرفت که پروتوکل استخراج ان بدین شرح می باشد:
- محلول DNG plus با قرار دادن در دمای ۳۷ درجه به مدت ۲۰ گرم می گردد.
- ۱۰۰میکرولیتر از نمونه خون با ۹۰۰ میکرولیتر از DNG plus مخلوط شده و ۱۵-۲۰ ثانیه ورتکس vortex)) می گردد، نمونه در این مرحله باید یکنواخت گردد و هر گونه تراکم یا لخته شدن باید با پیپت کردن از بین برود
- ۳۰۰ میکرو لیتر ایزوپروپانول به خون اضافه میشود. سپس نمونه ها را به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت rpm 12000 سانتریفوژ شود.
- نمونه را تخلیه نموده و روی دستمال کاغذی به صورت رو به پایین به مدت ۲-۳ دقیقه قرار گیرد
- ۱۰۰ میکرولیتر اتانول۷۵% به پلیت اضافه می گردد، سپس ۳-۵ دقیقه ورتکس نموده و در ۱۲۰۰۰rpm بمدت ۵ دقیقه سانتریفوژ گردد. این مرحله دو بار تکرار شود.
- اتانول را به طور کامل تخلیه نموده و پلیت دردمای ۶۵ درجه به مدت ۵ دقیقه خشک شود.
-
- DNA را در۵۰میکرولیتر آب مقطر استریل حل و در دمای ۶۵ درجه به مدت ۵ دقیقه قرار میگیرد. شستن دیواره تیوب برای حل کردن هرگونه پلت باقی مانده مفید خواهد بود.
- مواد حل نشده به مدت ۳۰ ثانیه در ۱۲۰۰۰rpm اسپین گردد، مواد شناور بر روی سطح حاوی DNA خالص است.
۳-۶ اندازه گیری کیفیت و غلظت DNA
اندازه گیری غلظت DNA توسط نانودراپ:
میزان خلوص DNA حاصل به وسیله نسبت جذبی nm 260 به nm280 تعیین شد. نسبت nm 260 به nm280 چنانچه بین ۹/۱ – ۶/۱ باشد، مطلوب است. نسبت‌های کمتر حاکی از آلودگی با پروتئین و ترکیبات آروماتیک (نظیر فنول) و نسبت‌های بالاتر نشان دهنده آلودگی با RNA است. جهت بررسی کیفیت نمونه‌ها در این پژوهش از ژل آگارز نیز استفاده شد. بدین منظور µl3 از DNA استخراج شده روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز شد. در شکل ۱-۳ کیفیت چند نمونه از DNA خالص شده مشاهده می شود.
شکل ۱-۳ تصویر مربوط به بررسی نتیجه استخراج DNA روی ژل آگارز(dna ladder از نوع bp 100)
۳-۷ دستورالعمل PCR برای نشانگر PCR-RFLP
