NM_009810/3

۱۳۸

AAAGACCATACATGGGAGCA
CGAGATGACATTCCAGTGCT

Caspase-3-F
Caspase-3-R

NM_001127233/1

۲۰۳

AACTTACCAGGGCAACTATG
TGTGCTGTGACTTCTTGTAG

TP53-F
TP53-R

NM_001289726

۱۲۵

GACTTCAACAGCAACTCCCAC
TCCACCACCCTGTTGCTGTA

GAPDH-F
GAPDH-F

جدول۲-۲-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده
۲-۸-۶-۲-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها
جهت اطمینان از صحیح بودن محل اتصال پرایمرها و بهینه کردن واکنش ها، ابتدا مراحل real-time PCR با بهره گرفتن از cDNA ساخته شده از RNA مستخرج از بیضه موش نابالغ انجام شد. در این مرحله پس از هر واکنشPCR ، محصول به دست آمده بر روی ژل الکتروفورز مورد ارزیابی قرار گرفت تا طول باندهای تشکیل شده، اتصال پرایمر به ژن مورد نظر را تأیید کند.
۲-۸-۷-الکتروفورز
۲-۸-۷-۱-روش ساخت بافر۵۰X TAE
ساخت این بافر در سه مرحله انجام می شود که دو مرحله ی اول آن برای ساخت EDTA است.

مرحله ی اول: ابتدا ۶/۹۳ گرم از EDTA به ۵۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر اضافه شده و با اضافه کردن ۱۵-۲۰ قرص NAOH به این محلول کدر، محلول شفافی حاصل می گردد.
مرحله ی دوم: در این مرحله، ۲۴۲ گرم Trizma base به ۵۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر اضافه شده و برای حل شدن کامل بر روی شیکر قرار می گیرد.
مرحله ی سوم: در این مرحله ۱۰۰ میلی لیتر EDTA با ۵۷ میلی لیتر اسید استیک مخلوط شد و به محلول حاصله در مرحله ی دوم اضافه گردید، حجم داخل ظرف با آب دوبار تقطیر به حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
۲-۸-۷-۲-روش ساخت بافر X TAE1
جهت ساخت ۱x TAE Buffer، ۲۰ میلی لیتر بافر ۵۰X TAE را با ۹۸۰ میلی لیتر آب مقطر ترکیب کرده و از این بافر برای تهیه ی ژل آگارز و همچنین برای پر کردن تانک الکتروفورز استفاده شد.
۲-۸-۷-۳-طرز تهیه ی ژل آگارز
ژل مورد استفاده برای بررسی کیفی RNAو همچنین بررسی اختصاصی بودن پرایمرها، با غلظت ۷/۱ درصد و با بهره گرفتن از محلول بافر X TAE1 تهیه شد. برای کمک به حل شدن آگارز، محلول به مدت ۱ دقیقه در داخل دستگاه ماکروویو قرار داده شد و پس از خارج کردن ژل از ماکروویو در صورت شفاف بودن محلول، به ازای هر ۱۰۰ میلی لیتر محلول، ۷ میکرولیتر رنگGel Red^[69] به محلول اضافه گردید.
۲-۸-۷-۴-بررسی آلودگی پرایمر
۸ میکرولیتر پرایمرForward و ۸ میکرولیتر پرایمر Reverse به صورت جداگانه با ۲ میکرولیتر Loading Die ترکیب شدند و مخلوط حاصل در چاهک های ژل قرار داده شدند. در نهایت پس از افزودن DNA Ladder bp50 به یکی از چاهک ها، تانک الکتروفورز به منبع تغذیه وصل شد و به مدت ۴۵ دقیقه با ولتاژ ۸۵ ران شد، سپس ژل از تانک الکتروفورز بیرون آورده شد و داخل دستگاه Gel documentation قرار گرفت. وجود یک تک باند واضح در موقعیت مناسب نسبت به Ladder بر روی ژل نشان دهنده عدم وجود آلودگی است.
۲-۸-۷-۴-بررسی کیفیت RNA
غلظت ۱۰۰۰ نانوگرم در میکرولیتر از RNA با ۲ میکرولیتر رنگ ترکیب شد و مخلوط حاصل در چاهک قرار گرفت و ژل با ولتاژ ۸۵ ران شد، وجود ۳ باند s 18 ،s 28 و s5 نشان دهنده ی بالا بودن کیفیت RNA و وجود اسمیر و عدم وجود باند نشان دهنده ی تخریب RNA است.
۲-۸-۸-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر
محلول حاوی مواد زیر تهیه شد.
cDNA 1 µl
Reverse Primer 1 µl
Forward Primer 1 µl
Master 12 µl