جهت انجام این آزمایش اسید استیک ۲% (v/v ) که به عنوان حلال است (محلول ۱) مورد نیاز می باشد. استاندارد ۱۰۰ میلی گرم در لیتر نیترات، که حاوی ۷۲۲/۰ گرم نیترات پتاسیم KNO₃ در یک لیتر آب است آماده شدند (محلول ۲). سپس سری محلول های استاندارد با غلظت ۰، ۲، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ میلی گرم در لیتر آماده شدند (محلول ۳). به این صورت که ۰، ۲، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ میلی لیتر از استاندارد ۱۰۰ میلی گرم در لیتر (محلول ۲) را به بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتر انتقال داده و با اسید استیک ۲% (محلول ۱) به حجم رسانده شد.
پودر مخلوط که حاوی ۳۷ گرم اسید سیتریک، ۵ گرم سولفات منگنزمونوهیدرات، ۲ گرم سولفانیل آمید، ۱ گرم N- 1 – نفتیل اتیلن دی آمین دی هیدروکلراید و ۱ گرم پودر روی است آماده می شود. سپس ۱/۰ گرم از پودر خشک شده گیاه را در ارلن مایر ۱۰۰ میلی لیتر ریخته ۵۰ میلی لیتر اسید استیک ۲% (محلول ۱) اضافه کرده به مدت ۳۰ دقیقه در شیکر دورانی هم زده و عصاره بدست آمده را با کاغذ صافی درجه ۲ صاف شد و مجدد از همان کاغذ صافی عبور داده شد تا عصاره کاملا صاف شود.
سپس ۱۰ میلی لیتر از سری محلول های استاندارد (محلول ۳) و ۱۰ میلی لیتر از عصاره صاف شده به لوله آزمایش درب دار انتقال داده شد. ۵/۰ گرم از پودر مخلوط به لوله ها اضافه گردید و ۳۰ ثانیه به شدت بهم زده و محلول رنگی ایجاد شده بلافاصله صاف شد بعد از ۱۰ دقیقه شدت رنگ ایجاد شده در طول موج ۵۴۰ نانومتر با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده شد.
میزان ازت نیتراته در ماده خشک گیاه برحسب میلی گرم در کیلوگرم(ppm) از رابطه زیر محاسبه می شود:
× ×= میزان ازت نیتراته در ماده خشک گیاه
که در آن:
-a غلظت نیترات در عصاره بر حسب میلی گرم در لیتر
b- غلظت نیترات در شاهد بر حسب میلی گرم در لیتر
w- وزن نمونه گیاه بر حسب گرم
D,M- درصد ماده خشک گیاه
۳-۲-۲- اندازه گیری نیتریت به روش دیازو
اصول این روش عبارت است از این که یونهای نیتریت آزاد در عصاره گیاه در مجاورت سولفانیل امید تولید ترکیب دیازنوم می کنند. این ترکیب باان(۱-نفتیل)اتیلن دی آمین، تولید کمپلکس آمینو آزو می نماید شدت رنگ کمپلکس رنگی در طول موج ۵۴۰ نانومتر قابل اندازه گیری می باشد.
محلول های مورد نیاز برای این آزمایش:

۱- اسید استیک CH₃COOH دو درصد(v/v)
۲- پودر مخلوط:۳۷گرم اسید سیتریک و ۲ گرم سولفانیل آمید و یک گرم ان-۱-نفتیل اتیلن دی آمین دی هیدروکلراید، جداگانه با هاون چینی کوبیده و با هم مخلوط می گردد. این مخلوط به مقدار مورد مصرف در همان روز آزمایش تهیه می شود.
۳- استاندارد ۱۰۰ میلی گرم در لیتر نیتریت:۴۹۲/۰گرم از نیترت سدیم در یک لیتر آب حل شد.
۴- سری محلولهای استاندارد با غلظت ۵/۰، ۵/۱ و ۰/۲ میلی گرم در لیتر: ۵/۰، ۵/۱ و ۰/۲ میلی لیتر از استاندارد ۱۰۰ میلی گرم در لیتر(محلول ۳) میکرو پیپت کرده و به بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتری منتقل و با اسید استیک ۲ درصد(محلول ۱) به حجم رسانده می شود.
روش کار:
۵/۰ گرم پودر گیاه توزین و به ارلن مایر ۱۰۰ میلی لیتری منتقل می شود. ۵۰ میلی لیتر از محلول ۲ درصد اسید استیک اضافه شده و به مدت ۳۰ دقیقه در شیکر دورانی بهم زده و صاف می شود. عصاره بدست آمده دویاره از همان کاغذ صافی عبور داده تا عصاره کاملا صاف بدست آید.
میزان ۱۰ میلی لیتر از عصاره و ۱۰ میلی لیتر از سری محلولهای استاندارد(محلول ۴) پی پت کرده و به لوله آزمایش درب دار منتقل می شود. ۵/۰ گرم از پود مخلوط اضافه کرده و مدت ۳۰ ثانیه به شدت بهم زده محلول رنگی ایجاد شده بلافاصله صاف می شود (با توجه به اینکه در اثر مجاورت عصاره با پودر مخلوط به علت احیای بیشتر ازت، رنگ تشکیل شده محو میگردد مدت زمان بهم زدن اهمیت زیادی دارد). بعد از ۱۰ دقیقه شدت رنگ ایجاد شده در طول موج ۵۴۰ نانومتر قرائت شد.
میزان نیتریت در ماده خشک گیاه برحسب میلی گرم در کیلوگرم(p.p.m) از رابطه زیر محاسبه می شود:
××۱۰۰= میزان نیتریت در ماده خشک گیاه
که در آن:
a- غلظت نیتریت در عصاره بر حسب میلی گرم در لیتر
b- غلظت نیتریت در شاهد بر حسب میلی گرم در لیتر
D.M- درصد ماده خشک گیاه
۳-۲-۳- اندازه گیری اسید آسکوربیک به روش اسپکتروفتومتری
روش تهیه محلول های استاندارد اسید آسکوربیک
استاندارد اسید آسکوربیک (۱/۲۹۰ = MW): محلول استاندارد ۱ میکروگرم بر میکرولیتر(mg 10 اسید آسکوربیک را در اسید متافسفریک ۵% حل نموده به حجم نهایی ml 10 رسانده شد) در روز استفاده تهیه گردید. سپس به ترتیب ۰, ۵, ۱۰ , ۲۵, ۵۰ , ۷۵ و ۱۰۰ میکرولیتر از این نمونه­ها را توسط محلول اسید متافسفریک ۵% به حجم  ml 1 رسانده شد.
حال ۳۰۰ میکرولیتر از هر نمونه استاندارد برداشته با ۷۵۰ میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم۱/۰ مولار و ۷۵ میکرولیتر دی تیو ترایتول ۱۰ میلی مولار مخلوط شده به مدت ۱۰ دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده شد. سپس ۱۵۰ میکرولیتر N-اتیل مالامید ۵/۰% به آن اضافه شده و پس از هم زدن با ورتکس به مدت ۱۰ دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار گرفت. ۳۰۰ میکرو لیتر تریکلرو استیک اسید ۱۰% +۳۰۰ میکرولیتر ارتوفسفریک لسید ۴۴% زیر هود+۳۰۰ میکرولیتر آلفا-آلفا دی پیریدیل+۵ میکرولیتر FeCl₃95%(475 میلی گرم در ۵/۰ میلی لیتر آب مقطر) اضافه شد. مخلوط حاصل ۲بار و هربار ۲۰ دقیقه در حمام آب گرم ۴۰درجه سانتی گراد قرار گرفت. قبل و بعد از هربار کاملا ورتکس شد و سپس در اسپکتروفتومتر با طول موج۵۲۵ نانو متر جذب آن خوانده شد.
مقداری از هرنمونه سبزی خام و پخته به صورت جداگانه داخل هاون کوبیده شد سپس ۵/۰گرم بافت تازه نمونه در ۱۰میلی لیتر متافسفریک اسید ۵% داخل لوله فالکون ریخته شدسپس به مدت ۱۵ دقیقه در ۵۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید.
۱۵۰میکرولیتر از عصاره سانتریفیوژ شده با ۳۷۵ میکرولیتر بافرفسفات پتاسیم ۱/۰ مولار و ۷۵ میکرولیتر دی تیو ترایتول ۱۰ میلی مولار مخلوط شده به مدت ۱۰ دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار داده شد. سپس ۱۵۰ میکرولیتر N-اتیل مالامید ۵/۰% به آن اضافه شد. پس از هم زدن با ورتکس به مدت ۱۰ دقیقه در درجه حرارت اتاق قرار گرفت. سپس ۳۰۰ میکرو لیتر تریکلرو استیک اسید ۱۰% +۳۰۰ میکرولیتر ارتوفسفریک لسید ۴۴% زیر هود+۳۰۰ میکرولیتر آلفا-آلفا دی پیریدیل+۵ میکرولیتر FeCl₃95%(475 میلی گرم در ۵/۰ میلی لیتر آب مقطر) اضافه شد. مخلوط حاصل ۲بار و هربار ۲۰ دقیقه در حمام آب گرم ۴۰درجه سانتی گراد قرار گرفت. قبل و بعد از هربار کاملا ورتکس شد و سپس در اسپکتروفتومتر با طول موج۵۲۵ نانو متر جذب آن خوانده شد.
۳-۳- تجریه و تحلیل آماری
این پژوهش در طرح بلوکی کاملا تصادفی و در سه تکرار اجرا شد. در این پژوهش اثر ۳ متغیر مستقل شامل نوع سبزی(هویج، کرفس، گوجه فرنگی، بادمجان، اسفناج و کدو سبز)، نوع فرایند(آب پز و سرخ شده) و زمان (روز صفر، سوم، ششم و نهم) بر متغیرهای وابسته غلظت اسید آسکوربیک، غلظت نیتریت و نیترات مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این طرح آزمایش از روش تجزیه و تحلیل چند متغیره (Univariate Analysis) و سپس آزمون دانکن به کمک نرم افزار SPSS نسخه ۲۱ استفاده گردید تا هم اثرات تکی متغیرهای مستقل و هم اثرات تقابلی آنها بر متغیرهای وابسته مورد بررسی قرار گیرد. برای بررسی همبستگی بین متغیرهای وابسته (غلظت نیتریت، نیترات و اسید آسکوربیک) از آزمون همبستگی پیرسون به کمک نرم افزار SPSS نسخه ۲۱ برای ویندوز استفاده شد.
فصل چهارم: نتایج و بحث
۴-۱- بررسی اثر نوع سبزی، فرایند و زمان نگهداری بر میزان اسید آسکوربیک
شکل شماره ۴-۱ اثرات زمان نگهداری در یخچال، نوع فرایند و نوع سبزی را بر غلظت اسید آسکوربیک نشان می دهد. جدول شماره ۴-۱ نیز نتایج تجزیه و تحلیل آماری تغییرات غلظت اسید آسکوربیک را نشان می دهد.
شکل ۴- ۱: روند تغییرات اسید اسکوربیک در روزهای مختلف نگهداری به صورت تابعی از نوع سبزی و فرایند
همان گونه که از نتایج مندرج در شکل ۴-۱ پیداست، روند تغییرات اسید آسکوربیک برای تمامی نمونه ها طی زمان نگهداری به صورت معنی داری (p<0.05) کاهشی بود. همان گونه که از نتایج جدول ۴-۱ هم پیداست اثرات نوع فرایند کاملا مشهود است و سبزیجات سرخ شده روند کاهشی بیشتری در میزان اسید آسکوربیک داشت. نتایج همچنین حاکی از آن است که میزان اسید آسکوربیک در اسفناج با حدود ۵۰ ppm از بقیه سبزیجات بیشتربود. کمترین میزان اسید آسکوربیک در به کرفس مشاهده شد (۳۳ ppm).
جدول ۴- ۱: غلظت اسید اسکوربیک (ppm)در سبزیهای مختلف در زمان های مختلف نگهداری در یخچال