جهت تجزیه نمونه های اسانس و اندازه گیری دقیق ترکیبات موجود در آن، از دستگاه کروماتوگراف گازی (GC) و کروماتوگراف گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) استفاده شد.

۳-۲-۳-۱- دستگاه کروماتوگرافی گازی^[۱۶۱]

دستگاه گازکروماتوگراف استفاده شده از نوعAgilent 6890 با ستون به طول ۳۰ متر قطر داخلی ۲۵/۰ میلیمتر و ضخامت لایه ۲۵/۰ میکرومتر از نوعHP-5MS بود. برنامه دمایی ستون به این نحو تنظیم گردید: دمای ابتدایی آون ۵۰ درجه سانتی گراد و توقف در این دما به مدت ۵ دقیقه گرادیان حرارتی سه درجه سانتیگراد در هر دقیقه افزایش دما تا ۲۴۰ درجه سانتی گراد با سرعت ۱۵ درجه در هر دقیقه افزایش دما تا ۳۰۰ درجه سانتیگراد و سه دقیقه توقف در این دما، دمای اتاقک تزریق ۲۹۰ درجه سانتی گراد بود و از گاز هلیوم به عنوان گاز حامل با سرعت جریان (فلو) ۸/۰ میلی متر در دقیقه استفاده گردید.

۳-۲-۳-۲- دستگاه کروماتوگراف گازی متصل به طیفسنج جرمی^[۱۶۲]

طیف نگار جرمی مورد استفاده مدلAglent 5973 با ولتاژ یونیزاسیون ۷۰ الکترون ولت روش یونیزاسیون EI و دمای منبع یونیزاسیون ۲۲۰ درجه سانتیگراد بود. شناسایی طیف ها به کمک شاخص بازداری آنها و مقایسه آن با شاخصهای موجود در کتب مرجع و مقالات و با بهره گرفتن از طیف های جرمی و ترکیبات استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه کامپیوتری صورت گرفت. طیف های بدست آمده از طریق مقایسه با طیف های جرمی ترکیب های استاندارد شناسایی شدند و سپس با بهره گرفتن از محاسبه شاخص های بازداری (RI) و با تزریق هیدروکربن های نرمال مورد تایید قرار گرفتند. درصد هر یک از ترکیبات نیز با توجه به سطح زیر منحنی آن در طیف کروماتوگرام حاصل از GC با روش Area Normalization بدست آمد (مرادی و همکاران، ۲۰۱۱).
داده های حاصل از آزمایش بر اساس طرح آماری مورد استفاده، توسط نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و از آزمون چند دامنه ای دانکن جهت مقایسه میانگین‏ استفاده شد و رسم نمودارها نیز توسط نرم افزار Excel انجام شد.

۳-۳- بررسی های مولکولی

۳-۳-۱- نمونه برداری و استخراج DNA

نمونه برگ ها برای استخراج DNA در نظر گرفته شد. برای استخراج DNA، حدود ۵۰ گرم از برگ های جوان و تازه آویشن برداشته و در داخل فویل آلومینیوم قرار داده تا زمان استخراج در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری گردید. برای استخراج DNA از روش دویل و دویل^[۱۶۳] ۱۹۹۰ مورد استفاده قرار گرفت.

۳-۳-۲- محلول های لازم جهت استخراج DNA

محلول های لازم جهت استخراج و شستشو DNA بر اساس غلظت و ماده شیمیایی به شرح زیر می باشد که در تهیه بافر استخراج، مواد با غلظت های لازم از استوک های اصلی برداشته و اتوکلاو گردید، سپس در حجم مورد نیاز استفاده شد.
بافر استخراج: CTAB3% (w/v)، تریس اسیدکلریدریک ۵۰ میلی مولار با ۸pH=، کلرید سدیم ۴/۱ مولار، اتیلن دی آمین تترا استیک اسید ۱۰ میلی مولار با ۸pH=، بتامرکاپتواتانول ۱ %(v/v) ، پلی وینیل پیرولیدن ۲ % (w/v).
سدیم دودسیل سولفات ۱۰%
کلرفرم – ایزوآمیل الکل: ۲۴ به ۱ (v/v)
برای تهیه این محلول یک حجم از ایزوآمیل الکل با ۲۴ حجم از کلروفرم مخلوط شده و به دور از نور در یخچال نگهداری شد.
بافر CTAB5% (w/v) به همراه NaCl 7/0 % (w/v)
ایزوپروپانول
اتانول ۷۰% و ۹۶%
استات پتاسیم ۵ مولار با ۵/۵pH=

۳-۳-۳- مراحل استخراج DNA

استخراج DNA بترتیب شامل مراحل زیر است:
- توزین ۳۰ میلی گرم نمونه برگی خشک.
- پودرکردن نمونه برگی در حضور ازت مایع در هاون چینی اتوکلاو شده .
- انتقال نمونه ها به لوله های سانتریفیوژ ۲ میلی لیتری و افزودن ۸۵۰ میکرولیتر بافر استخراج گرم شده (۶۵ درجه سانتیگراد) به هر نمونه.
- افزودن ۳ میکرولیتر مرکاپتواتانول به هر نمونه.
- قرار دادن نمونه در حمام آبگرمC˚۶۵ به مدت ۳۰ دقیقه به همراه چندین مرتبه سروته کردن لوله ها.
- اضافه کردن ۱۷۰ میکرولیتر استات پتاسیم و پنج دقیقه به صورت مرتب لوله ها را سروته می کنیم.
- اضافه کردن ۶۰۰ میکرولیتر مخلوط کلروفرم ایزوآمیل الکل به نسبت ۲۴ به ۱ تا هر لوله تا پر شود و چندین مرتبه سروته کردن لوله ها.
- سانتریفیوژ با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد.
- برداشتن روشناور و انتقال به لوله سانتریفوژ ۲ میلی لیتری جدید با بهره گرفتن از سمپلر.
- اضافه کردن ۳۰۰ میکرولیتر مخلوط کلروفرم ایزوآمیل الکل به نسبت ۲۴ به ۱ تا هر لوله تا پر شود
- سانتریفیوژ با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۵ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد.
- تکرارمرحله ۱۰٫
- اضافه کردن ۸۰۰ میکرلیتر ایزوپروپانول خالص سرد (حدود ۲۰- درجه) به سوپرناتانت جدا شده و چندین مرتبه سروته کردن لوله ها و نمونه ها به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۰- نگهداری می شوند.
- سانتریفیوژ با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد.
- حذف کل اتانول داخل لوله ها به آرامی،طوری که رسوب در لوله باقی بماند و لوله ها حاوی پلیت را به مدت ۳۰ دقیقه در معرض جریان هوا قرار می دهیم تا رسوب حاصله خشک شود.
- اضافه کردن ۸۰۰ میکرولیتر استات آمونیوم ۵/۲ مولار با الکل مطلق به نسبت ۳ به ۷ و چندین مرتبه سروته کردن لوله ها به آرامی و نگهداری به مدت ۲۵ دقیقه در دمای ۲۰-.
- سانتریفیوژ با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد.
- حذف مایع رویی و اافه کردن ۶۰۰ میکرولیتر الکل ۷۰ درصد به هر تیوپ.
- سانتریفیوژ با ۶۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد.
- حذف کل اتانول داخل لوله ها به آرامی، طوری که رسوب در لوله باقی بماند و لوله ها حاوی پلیت را به مدت ۲۰ دقیقه در معرض جریان هوا قرار می دهیم تا رسوب حاصله خشک شود.
- اضافه کردن ۵۰ میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر استریل به لوله ها و قرار دادن نمونه به مدت ۲۴ ساعت در یخچال در دمای ۴ درجه ساتیگراد تا توده DNA داخل آب حل شود و در نهایت به فریزر منتقل می کنیم.

۳-۳-۴- تعیین غلظت و کیفیت DNA

جهت اندازه گیری غلظت DNA از روش اسپکتوفتومتری استفاده شد. برای تعیین غلظت DNA استخراج شده از دستگاه اسپکتوفتومتر ((Nono Drop – ND – ۱۰۰۰ استفاده شد. ابتدا دستگاه به وسیله آب مقطر کالیبره شده و سپس ۲ میکرولیتر DNA با دستگاه مذکور اندازه گیری شد و جذب نور در طول موج های ۲۶۰-۲۸۰ نانومتر قرائت گردید. میزان جذب در طول موج ۲۶۰ ناتومتر نشان دهنده مقدار جذب نور توسط DNA بوده و طول موج ۲۸۰ نانومتر نشان دهنده میزان جذب پروتئین ها است. نسبت جذب نمونه ها در طول موج ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر، خلوص DNA را نشان می دهد. این نسبت باید در یک نمونه DNA خالص حدود ۲/۰±۸/۱ باشد. غلظت DNA بر حسب نانوگرم بر میکرولیتر محلول بیان می گردد. در نمونه های بررسی شده، نمونه هایی مورد قبول واقع شدند که غلظت DNA آن ها بالاتر از ۱۵۰ نانوگرم بر میکرولیتر بودند. به منظور تعیین کیفیت DNA استخراج شده پنج میکرولیتر از محلول DNA با یک میکرولیتر بافر رنگ مخلوط گردید و از ژل آگارز ۸/۰ درصد عبور داده شد.

۳–۳–۵- انگشت نگاری DNA با بهره گرفتن از تکنیک ISSR

۳-۳-۵-۱- انتخاب آغازگرها

به منظور انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) برای تعیین تنوع ژنتیکی جمعیت های آویشن کوهی با بهره گرفتن از نشانگر ISSR، ۱۹ آغازگر ISSR از روی تحقیقات انجام شده بر روی جنس آویشن مورد بررسی قرار گرفتند. بر اساس تکثیر موفقیت آمیز، تکرار پذیری، تولید قطعات پلی مورفیک و وضوح قطعات تکثیر شده، ۱۹ آغازگر برای مطالعات مولکولی انتخاب شدند. لیست آغازگرهای مورد استفاده و توالی آن ها در جدول ( ۳-۴) آمده است.

۳–۳–۵-۲- آماده سازی مخلوط PCR و تکثیر قطعات DNA

مقادیر حجمی هر یک از مواد به کار رفته در یک واکنش PCR در حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر از مخلوط واکنش PCR شامل ۷۵/۳ میکرولیتر DNA ژنومی، ۵/۲ میکرولیتر بافر PCR X 10، ۵/۱ میکرولیتر mMdNTPs5/2، ۱ میکرولیتر آغازگر تصادفی، ۲/۰ میکرولیتر (۱U) آنزیم DNA Taqپلیمراز، ۲ میکرولیتر کلرید منیزیم ۲۵ میلی مولار و ۰۵/۱۴ میکرولیتر آب دیونیزه انجام شد. کلیه مواد به کار رفته از شرکت فرمنتاز^[۱۶۴] تهیه شد. کلیه مواد فوق به جزء DNA ژنومی در یک میکروتیوب ۵/۱ میلی لیتری استریل ریخته و توسط میکروپیپت با نوک استریل چند بار به آرامی هم زده شده تا به خوبی مخلوط گردد. برای احتیاط بسته به تعداد نمونه در هر برنامه حرارتی PCR، این مخلوط در حدود ۱۰ درصد بیش از حجم مورد نیاز تهیه و تمام مراحل تهیه واکنش PCR روی یخ انجام شد.