ستون‌های متداول
۶/۴
۲۰-۵
۲۰۰۰-۵۰۰
قطر باریک
۲
۵-۱
۲۰۰
قطر میکرو
۱
۲-۵/۰
۵۰
موثینه
۵/۰
۱/۰
۵
جریان نانو
۰۵/۰
nL
۱/۰
طول ستون‌ها معمولاً cm15 و قطر داخلی آنها mm6/4 است. اما ستون‌هایی با قطر داخلی و طول دیگر هم وجود دارند. ابعاد ستون عبور جریان و مقدار نمونه تزریق شده را تعیین می‌کند و تأثیر زیادی بر زمان انجام یک آزمایش دارد.
معمولاً برای انجام سریعتر آزمایش (زمان کوتاهتر) از ستون‌های با طول کمتر (cm5-3) و قطر داخلی کوچکتر (mm2-1) استفاده شود.
استفاده از ستون‌های موثینه (با قطر داخلی در محدوده ۳۰۰-۱۸۰) هرچه بیشتر روبه افزایش است زیرا از یک طرف آزمایش سریعتر انجام می‌شود و از طرف دیگر به دلیل مصرف حلال کمتر، ارزان‌تر است.
آشکارساز فرابنفش (UV)
آشکارسازی‌های فرابنفش به دلیل قابلیت استفاده زیاد، برای آنالیز بسیاری از ترکیبات آلی مورد استفاده قرار می‌گیرند. همچنین به دلیل سادگی در اجرای آزمایش، متداول‌تر از دیگر آشکارسازها هستند. تصویر مقطعی از سل جریان فرابنفش آمده است.
وقتی اجزاء نمونه جاذب فرابنفش از ستون وارد مسیر نوری سل جریان می‌شود، تابش فرابنفش جذب شده و یک علامت کاهش یافته در آشکارساز ایجاد می‌شود. به این دلیل که هر جزئی که از میان سل جریان عبور کند، به صورت یک نواری از جزء حل شده است، آشکارساز، پیک به شکل گوسین نرمال را ثبت می‌کند. توانایی ترکیب برای جذب تابش فرابنفش (یا مرئی) به کروموفرهای آن در ساختار مولکولی بستگی دارد.
آشکارساز ضریب شکست (RI)
اندازه علائم آشکارساز تابعی از ضریب شکست مایع (فاز متحرک) در سل جریان می‌یابد. وقتی اجزاء نمونه وارد سل جریان می‌شوند ضریب شکست مایع تغییر می‌کند و مطابق آن پاسخ آشکارساز نیز تغییر می‌کند.
در یک آشکارساز ضریب شکست (RI) دیفرانسیلی یک سل جریان مرجع نزدیک به سل جریان نمونه قرار می‌گیرند. در اینجا نتیجه (خروجی) آشکارساز معادل است با اختلاف علائم ناشی از پرتو نمونه و پرتو مرجع. استفاده از این نوع طراحی، توانایی اشکارسازی را بیشتر و حساسیت نسبت به تغیرات شدت منبع نور و درجه حرارت آشکارساز را کمتر می‌کند.
بررسی باقیمانده آنتی‌بیوتیک‌ها با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
مراحل آنالیز ترکیبات مورد نظر شامل ۲ مرحله استخراج و سنجش بود، در مرحله اول با بهره گرفتن از روش فاز مایع – مایع ترکیبات آنتی‌بیوتیک از نمونه جدا شدند و نمونه قابل تزریق به سیستم HPLC فراهم شد در مرحله دوم نمونه‌های استخراج شده توسط سیستم HPLC آنالیز شدند. لازم به ذکر است که قبل از انجام آنالیز نمونه‌های واقعی، ابتدا راه‌اندازی روش سنجش HPLC و معتبرسازی آن انجام گردید. بدین منظور غلظتهای مختلف از تتراسایکلین وکلرامفنیکل وپنیسیلین(ng/ml 1000-0) هریک با ۳ بار تکرار در روزهای مختلف به۵ccو۵gr نمونه اضافه شد (Spike) و همانند مراحل شرح داده شده در روش استخراج و کروماتوگرافی، روی نمونه حاوی مقادیر معلوم ترکیبات آنتی‌بیوتیک مراحل مذکور انجام گردید. مشخصات آنالیز شامل میزان حساسیت، تکرارپذیری، میزان بازیافت، خطی بودن پاسخ‌ها و عدم وجود پیک مزاحم به دست آمد.
تهیه محلول مادر
برای تهیه محلول مادر از تتراسایکلین وکلرامفنیکل وپنسیلین ۱۰mg از این ۴دارو برداشته و هرکدام جداگانه با آب مقطر دیونیزه به حجم ۱۰cc رسانده شد. و محلول مادر با غلظت ng/ml1 برای هرکدام به دست آمد و در داخل یخچال و یا در فریزر در دمای c20- نگهداشته شدند.
همچنین تتراسایکلین‌ها آنتی‌بیوتیک‌هایی ناپایداری هستند که اغلب تغییر رنگ می‌دهند (از زرد به قهوه‌ای) بنابراین باید لوله‌های حاوی محلول مادر را در داخل فویل آلومینیومی نگهداری شود.
تهیه محلول‌های کاری روزانه آنتی‌بیوتیک های مورد نظر
محلول‌های استاندارد کاری با رقیق ساختن محلول مادر با آب دیونیزه ساخته می‌شوند. محلول‌های کاری نیز باید از مواجهه با نور محافظت شوند.
۱cc از محلول اکسی تتراسایکلین و ۱cc از محلول مادر تتراسایکلین جداگانه برداشته و با آب مقطر و با بالن ژوژه‌های جداگانه هر دو محلول را به حجم ۱۰cc می‌رسانیم تا غلظت ۱۰۰ به دست بیابد و به همین ترتیب رقت‌های بعدی تهیه گردید.برای آنتی بیوتیکهای پنی‌سیلین و کلرامفنیکل نیز به همین روش عمل می کنیم.
روش استخراج
برای استخراج به ترتیب زیر عمل گردید:
۱۰gr از نمونه را برداشته و ۳۰ml آب به آن می‌افزاییم با دور ۲۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کرده، سپس ۲۰ml از مایع رویی را برداشته، ۵۰ml اتیل‌استات به آن می‌افزاییم. مخلوط کرده و اتیل‌استات را جدا می‌کنیم و می‌گذاریم خشک شود و به آن ۲ml متانول می افزاییم و ۲۳gr نمک ۶% و ۲۰ml هگزان می‌افزاییم سپس هگزان را خارج کرده و دور می‌ریزیم. سپس ۳۰ml دیگر اتیل‌استات می‌افزاییم پس از مخلوط کردن اتیل استات را خارج کرده خشک می‌کنیم، سپس۹ml آب و ۱ml متانول می‌افزاییم و آن را تزریق دستگاه می‌کنیم.
روش تهیه فاز متحرک
فاز متحرک: ۱۰ml استات آمونیوم ۱% اسید استیک و ۹۵ml متانول و ۵ml آب مخلوط می‌کنیم و صاف می‌کنیم.
