۲- پس از ۲۴ ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را انتخاب کرده و به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح کرده و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار داده تا باکتری رشد کنند.
۳- یک میلی لیتر از محیط فوق را به ۵ میلی لیتر محیط LB تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار داده شود . ۲ تا ۳ ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب ۵/۰ تا ۸/۰ در۵۰۰ نانومتر را می دهد.
۴- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و ۵ الی ۱۰ دقیقه روی یخ نگه دار شوند .
۵- میکروتیوب ها ۳ دقیقه در ۹۰۰ دور سانتریفیوژ شود.
۶- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری در یک میلی لیتر محلول استریل ۱/۰ مولار کلرید کلسیم حل شود .
۷- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول مذکور روی یخ انکوبه گردد .
۸- این بار رسوب در ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل ۱/۰ مولار حل شود .
۹- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول روی یخ انکوبه گردد.
۱۰- سپس محلول به مدت ۳ دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ شود .
۱۱- رسوب در ۳۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل شود.
۱۲- به مدت ۲۰ دقیقه محلول بر روی یخ قرار داده شود.
این باکتری ها تا ۷۲ ساعت روی یخ رد یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیرول استریل ۳۰ درصد آن ها را در ۷۰- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
۳-۵-۳-۲ ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coliBL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
مراحل انجام کار به صورت زیر است:
۱- ابتدا ۱۰۰ میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) روی یخ ذوب گردد.
۲- ۳۰ میکرولیتر از محصول لایگیشن را به ۱۰۰ میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه کرده به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
۳- این مخلوط به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ انکوبه گردد.
۴- نمونه ها را به مدت ۹۰ ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتیگراد قرار داده و بلافاصله به روی یخ منتقل و ۵ دقیقه بدون حرکت روی یخ بماند.
۵- مخلوط فوق را به ۹۰۰ میکرولیتر از محیط LB فاقد کانامایسین افزوده و به مدت ۵/۱ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه قرار داده شود تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
۶- مخلوط فوق به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ شود.
۷- ۸۰۰ میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در ۲۳۰ میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل گردد.
۸- ۲۳۰ میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LBآگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی داده، کاملا جذب محیط شده و سپس به مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری گردد.
۳-۵-۴ ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود ۱ تا ۲ میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در ۵ میلی لیتر LBبراث کانامایسین دار تلقیح و به مدت یک شب در ۳۷ درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه شود. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3)، پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ما را دریافت کرده است .
۳-۵-۵ استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه Vپروتئین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه الودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت. مراحل انجام کار بصورت زیر است:
۱- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، ۵/۱ میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب ۵/۱ منتقل می شود.
۲- سپس به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ شود.
۳- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته: برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.

۴- در این مرحله ۲۵۰ میکرولیتر از بافر محلول کنندهکه دارای RNAaseاست به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم زده شود تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
۵- ۲۵۰ میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه کرده سپس آن را ۴ تا ۶ بار سروته کرده تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
۶- در مرحله ی بعد ۳۵۰ میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه شود. سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته کرده تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
۷- سپس به مدت ۵ دقیقه در ۹۰۰۰ دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
۸- محلول روئی را نگه داشته و رسوب دور ریخته شود.
۹- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل شود. این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
۱۰- ستون حاوی محلول به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ گردد.
۱۱- محلول روئی دور ریخته شود.
۱۲- به ستون ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو اضافه گردد.
۱۳- به مدت ۴۵ ثانیه در ۰۰۰/۱۲ دور ستون سانتریفیوژ گردد.
۱۴- مرحله قبل یکبار دیگر تکرار شود.
۱۵- محلول درون ستون دور ریخته شود.
۱۶- ستون به مدت ۱ دقیقه دیگر در ۰۰۰/۱۲ دور سانتریفیوژ شده تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
۱۷- ستون را درون یک میکروتیوب ۵/۱ قرار داده و سپس بافر جدا کننده به میزان ۵۰ میکرولیتر به ستون اضافه شود . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. ۲ الی ۳ دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
۱۸- به مدت ۲ دقیقه در ۰۰۰/۱۲ دور ستون در درون میکروتیوب۵/۱ سانتریفیوژ شود.
۱۹- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
۳-۵-۶ تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید بیانی pet-28a که حاوی ژن ناحیه VپروتئینALCAM انتقال داده شده به ان به کمک تکنیک لایگیشن است وتایید وجود ان، با توجه به جایگاه های آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن ناحیه V پروتئینALCAM می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده گردند.
۳-۵-۶-۱ هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion و الکتروفورز