برای تهیه بافر TAE50xاز موارد زیر استفاده می شود:

TRIS : 5/60 گرم
EDTA ۵/۰ مولار ( در ۸PH = ) :۲۵ میلی لیتر
اسید استیک:۲۸/۱۴ میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به ۲۵۰ میلی لیتر برسد
حجم نهایی:۲۵۰ میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر ۵۰xTAEرا به بافر TAE1x مورد استفاده دربیاید باید در حجم مناسب رقیق شود .
۳-۴-۵-۲-۲ تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Lowاستفاده شد . برای تهیه ی ژل ۱٫۵ درصد آگارز۰٫۶ گرم آگارز را در ۴۰ میلی لیتر از بافر TAE1xحل کرده و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی مخلوط شود . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت داده تا کاملا ذوب شود . این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد . باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده باشد .
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای ۵۰ تا ۶۰ درجه سرد شد ، رنگ گرین ویوئر^[۱۰۹] را به میزان ۲ میکرولیتر به آن اضافه کرده و به ظرف مناسب شانه دار منتقل و بعد از مدت ۱۵ دقیقه در دمای محیط ژل کاملا آماده است . این ژل در حضور بافر TAE1xتا یک هفته در دمای ۴ درجه قابل نگه داری است.
۳-۴-۵-۲-۳ Runکردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . میزان بافر TAE ۱xدرون تانک الکتروفورز باید به حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را به همراه (loading dye) در درون چاهک ریخته و از یک مارکر وزن مولکولی kb ۱ هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهکها استفاده شد .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ ۹۵ ولت و ۵۵ آمپر الکتروفورز انجام داده شد .
وقتی رنگ تا حدود ۳/۲ ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه (Gel documentation) مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۵ ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM
جهت بیان ژن ناحیه V پروتئین ALCAMاز باکتری E.coliBL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از ژل اگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.ColiBL21 ترانسفورم شد.
۳-۵-۱ تخلیص DNAناحیه V پروتئین ALCAM از ژل
برای تخلیص ازکیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل ۳-۹ )
شکل ۳-۹.کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز
روش انجام ان بصورت زیر می باشد:
۱- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNAناحیه V پروتئین ALCAMدر آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم شود .
۲- به ۳/۱ میلی گرم از ژل حاوی DNAنوترکیب ، ۴۰۰ میکرولیتر Binding Bufferدر داخل یک میکروتیوب اضافه شود.
۳- مخلوط را به داخل بن ماری ۵۵ درجه انتقال داده و به مدت ۵ دقیقه انکوبه کرده برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر ۲ دقیقه هم زده شود .
۴- ۵ میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه شود.
۵- ۵ دقیقه در بن ماری ۵۵ درجه قرار داده تا سیلیکا به خوبی حل شود.
۶- به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور ریخته شود .
۷- ۵۰۰ میکرولیتر washingbufferبه میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط شود.
۸- به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی دور ریخته شود.
۹- مرحله ی ۷ و ۸ را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
۱۰- ۳۰ میکرولیتر بافر TEبه رسوب اضافه کرده و ورتکس کرده تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
۱۱- میکروتیوب به مدت ۵ دقیقه در ۵۵ درجه قرار داده شود .
۱۲- به مدت ۱ دقیقه میکروتیوب را در ۰۰۰/۱۵ دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود . اینک محلول رویی حاوی DNA تخلیص شده است.
۳-۵-۲ لایگیشن
برای اتصال DNAناحیه V پروتئین ALCAM استخراج شده از ژل با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگاز^[۱۱۰]استفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاژ T4استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.
روش انجام این عمل به شکل زیر است:
۱- محتویات واکنش بصورت زیر مخلوط شود.
بافر لایگیشن x10 : ۳ میکرولیتر
آب استریل: ۹ میکرولیتر
DNAلیگاز T4: 1 میکرولیتر
پلاسمید Pet-28a: 2 میکرولیتر
Insert(DNAناحیه V پروتئین ALCAM) :15 میکرولیتر
حجم نهایی: ۳۰ میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم DNAلیگاز T4اضافه شود.
۲- به کمک دستگاه انکوباتور میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش به مدت ۴ ساعت در ۱۶ درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد انکوبه شد .
۳-۵-۳ ترانسفورماسیون
بدین منظور از سویه E.coliBL21(DE3)که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده شد . این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد .
۳-۵-۳-۱ اماده سازی سلول های شایسته
۱- باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شود.