تکثیر ژن­های hrpW , hrpG با واکنش زنجیره­ای پلیمراز
طراحی آغازگرهای مناسب
توالی مطلوب آغازگر و غلظت مناسب آن از فاکتورهای اساسی ایجاد حداکثر Specificity و efficiency در PCR است. یک آغازگرضعیف طراحی شده می‏تواند موجب عدم تولید یا تولید ناچیز محصول همراه با محصولات غیراختصاصی و یا ایجاد دایمر شود.
ژن­های hrpW , hrpG به‏عنوان ژن­های هدف در این مطالعه انتخاب و طراحی پرایمر براساس آن انجام گرفت، بدین منظور ابتدا توالی کامل این ژن­ها از سایت اطلاعات NCBI با شماره دستیابی ۱۱۵۵۳۳۶ و ۱۱۵۶۹۹۳ به ترتیب برای ژن­های hrpW , hrpG جستجو شد و سپس جایگاه‏های آنزیمی موجود بر روی این توالی‏ها توسط نرم افزار Vector NTI بررسی و بدین منظور برای طراحی آغازگرها از نرم افزار oligo7 استفاده گردید.

با شناسایی جایگاه­های uniqe در ناقل­های کلونینگ و همچنین ناقل بیانی و از طرفی نبود جایگاههای مذکور در ساختار نوکلئوتیدی ژن‏ها، سه جایگاه BamHI/ SacI , XbaI به ترتیب در انتهای َ۵ و َ۳ آغازگرها قرار داده شد. آغازگرهای hrpW2 , hrpW1 با جایگاه برشیXbaI در آغازگر رفت و همچنین SacI در آغازگر برگشتی مربوطه و آغازگرهای hrpG4 , hrpG3 با جایگاه‏های BamHI , XbaI به ترتیب در آغازگر‏های رفت و برگشت به‏گونه ­ای که ORF مربوطه را خوانش نمایند، با موفقیت استفاده شد.
بهینه­سازی شرایط واکنش زنجیره­ای پلیمراز
در یک واکنش زنجیره­ای پلیمراز که توسط آنزیم­ های با خاصیت پلیمرازی مانند Taq یا pfu صورت می‏گیرد عوامل مختلفی درگیرند، که هر کدام با توجه به حساسیت این واکنش می ­تواند به نوبه­ی خود بر روند نتیجه ­گیری موثر باشند، با توجه به این امر در این پژوهش ابتدا با کمک Taq دی.ان.آن پلیمراز و تست­های شیب دمایی و رقت شرایط بهینه برای عوامل مختلف و موثر در انجام واکنش ایجاد شد. آزمایش‏های اولیه مشخص کرد که غلظت ۲۵-۵۰ نانوگرم بر مایکرولیترDNA (رقت یک بیستم) در ترکیب واکنش مناسب­ترین است.
در ادامه تیتراسیون غلظت­های مختلف منیزیوم و آغازگرها، منیزیوم با غلظت ۱ میلی مولار و آغازگرها با غلظت ۲ پیکومول در مایکرولیتر برای هر کدام آغازگرها بدست آمد، که این شرایط باعث تکثیر مناسب قطعه­های مورد هدف بصورت تک باند با جلوگیری از تکثیر محصولات ناخواسته شد، بهترین دمای اتصال برای آغازگرها و همچنین زمان بهینه این رخداد نیز با آنزیم Taq دی.ان.آ پلیمراز و طی تست شیب دمایی انجام شد، که بهترین دمای اتصال ۶۳ و ۶۱ به ترتیب برای پرایمرهای hrpW1/2 , hrpG3/4 و مدت زمان ۵۰ ثانیه برای اتصال آغازگرها انتخاب گردید. افزایش دما نسبت به مقدار بهینه، باعث عدم تکثیر مناسب قطعه شده و کاهش دما، تکثیر قطعات غیراختصاصی به همراه داشت. در نهایت و پس از بهینه­سازی شرایط واکنش زنجیره­ای پلیمراز، این واکنش با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز در حجم ۵۰-۲۰ مایکرولیتری انجام شد و تک باند‏های مورد انتظار به صورت ۹۱۲ و ۷۹۲ جفت باز حاصل شد (شکل ۴-۳). استفاده از آنزیم pfu به‏دلیل قابلیت این آنزیم در تصحیح خطا در طی فرایند تکثیر و همچنین عدم اضافه کردن نوکلئوتید A به انتهای محصول واکنش نسبت به Taq دی.ان.آ پلیمراز می­باشد.
۷۹۲bp
۹۱۲bp
۷
۶
۵
۴
۳
۲
۱
L
شکل۴-۳- واکنش زنجیره­ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و شیب دمایی جهت بهینه­سازی بهترین دمای اتصال
L: مارکر Kb1، ۱: کنترل منفی، ۲-۳-۴: hrpW، ۵-۶-۷: hrpG
الکتروفورز محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز
شکل زیر نمایانگر تکثیر کارآمد قطعات ۹۱۲ و ۷۹۲ جفت بازی مربوط به ژن‏های hrpG , hrpW می­باشد. علی­رغم استفاده از ۵ مایکرولیتر محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز باندهای موردنظر با وضوح بالا و به‏صورت تک باند، حکایت از شرایط بهینه آزمایش دارند. همچنین عدم وجود باند در چاهک مربوط به کنترل منفی دلالت بر عدم آلودگی در آزمایش مذکور می‏باشد.
۷۹۲bp

L

۱

L
۹۱۲bp