شکل ۴-۱٫ شاخص سازگاری کدون. سمت راست : قبل از بهینه سازی ، سمت چپ : بعد از بهینه سازی
بدین ترتیب میزان فراوانی کدون های بهینه^[۵۲] (FOP) نیز افزایش یافت به صورتی که کدون های کاملا اپتیموم برای توالی امینواسیدی در نظر گرفته شده از ۴۳% در توالی اولیه به ۷۰% در توالی بهینه شده افزایش یافتند. دیگر کدون ها هم در بهترین حالیت که در توالی می توانستند حضور یابند به صورت بهینه درآمدند.

FOP اپتیموم نشان گر بیان کاملا دقیق کدون های کد کننده امینواسیدها هستند ، بدین معنی که با توجه به میزان تغییراتی که در کل توالی می تواند صورت گیرد ، برای یک امینواسید خاص ، این کدون در میزبان بالاترین راندمان بیانی را می تواند داشته باشد (شکل ۴-۲)
شکل ۴-۲٫ میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ : قبل از بهینه سازی ، سمت راست : بعد از بهینه سازی
شاخص محتوای G-C
میانگین محتوای G-C یک توالی مناسب بین ۳۰% تا ۷۰% (بطور میانگین ۵۰%) می باشد. شاخص محتوای G-C توالی اولیه از میزان ۵۹/۴۱% به ۵۶/۴۸% در توالی بهینه سازی شده افزایش یافت که این امر سبب افزایش نیمه عمر mRNA ژن موردنظر می شود (شکل ۴-۳)
شکل ۴-۳٫ شاخص محتوای G-C. سمت راست : قبل از بهینه سازی ، سمت چپ : بعد از بهینه سازی
با توجه به پارامترهای تغییر یافته ، توالی ۱۴۶۳ نوکلئوتیدی نهایی برای ژن CD166 در شکل ۴-۴ نشان داده شده است. همچنین در شکل ۴-۵ نیز توالی اولیه و توالی بهینه سازی شده را بطور مقایسه ای و نوکلئوتید به نوکلئوتید می توان مشاهده کرد.
شکل ۴-۴٫ ترادف مولتی توپ ژنی موردنظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli
شکل ۴-۵٫ مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.
۴-۲ سنتز شیمیایی DNA موردنظر نوترکیب
توالی ژن موردنظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد. این وکتور قبلا به نام pBMH شناخته می شد که طولی برابر با ۲۹۰۷bp دارد. این وکتور دارای ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین می باشد که می توان از آن برای جداسازی کلونی های نوترکیب استفاده کرد. طول توالی بعد از سنتز ژن به داخل پلاسمید به ۴۳۷۰ bp رسید. توالی سنتز شده تمام مراحل کنتری کیفیت را با موفقیت گذراند. از جمله این مراحل می توان به موارد زیر اشاره کرد.
تائید صحت توالی ژن نوترکیب
تائید صحت توالی پلاسمید حامل
تائید صحت شکل خواندن (Reading Frame) در فرایند رونویسی
تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی (شکل ۴-۶)

Gene name:CD166 ext
Clone ID#:D5913-2
RES: HindIII
Construct map:
شکل ۴-۶٫ تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی
تایید سحت قابلیت تکثیر ژن به کمک تکنیک PCR و عدم وجود هر گونه آلودگی در آن
کیفیت مناسب DNA سنتز شده به کمک تکنیک اسپکتروسکوپی^[۵۳]
و عدم وجود هر گونه آلودگی در آن
شکل ظاهری شفاف و عدم وجود هر گونه ذره ی خارجی در آن
سفارش مذکور به شکل پودر لیوفیلیزه و در حجم ۱۰ میکروگرم دریافت شد و سپس بصورت استوک قابل استفاده با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده درآمد. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA نوترکیب CD166 در شکل ۴-۷ نمایش داده شده است. در این شکل جایگاه ژن موردنظر ، نحوه قرارگیری آن در پلاسمید حامل ، جایگاه آنزیم های محدود کننده و همچنین جایگاه ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین نشان داده شده است

شکل ۴-۷٫ نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA نوترکیب CD166
۴-۳ کلونینگ پلاسمید AMP–pBSK حاوی DNACD166
جهت تکثیر پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ارسال شده توسط شرکت تولیدی ، فرایند ترانسفورمیشن برای باکتری های کامپتنت E.coli سویه Top 10 انجام شد و از کلونی های رشد کرده در محیط دارای آنتی بیوتیک آمپی سیلین ، تک کلونی انتخاب شد و سپس از تک کلونی های انتخاب شده به روش لیز قلیایی استخراج پلاسمید صورت گرفت. جهت تائید حضور پلاسمید در محلول بدست آمده ، الکتروفورز انجام شد. با پدیدار گشتن باند ۴۳۶۶ bp در ژل ، حضور پلاسمید حاوی ژن CD166 محرز گشت. در شکل ۴-۷ ، نتیجه حاصل از الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید نشان داده شده است.
شکل ۴-۷٫ تائید حضور پلاسمید حاوی ژن CD166 در محصول استخراج پلاسمید- از سمت راست چاهک اول نمونه پلاسمید حاوی ناحیه مورد نظر و چاهک دوم لدر DNA1kb-پیکان قرمز باندbp4366 مربوط به پلاسمید حاوی ناحیهCD166 و پیکان ابی محل باند ۳۰۰۰bp لدر .
پس از این که وجود پلاسمید در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن سنتز شده CD166 تائید شد ، به کمک تکنیک هضم دوگانه آنزیمی ، وجود ژن CD166 در پلاسمید ، با توجه به جایگاه های آنزیمی Ncol و Xhol قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. دو باند دلخواه ۱۴۶۳ bp (CD166) و ۲۹۰۷ bp (پلاسمید pBSK) نمایان گشت که تائیدی بر وجود ژن موردنظر در پلاسمید تکثیر شده دارد.
شکل ۴-۹٫ نتیجه حاصل از هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید تکثیر یافته pBSK را نشان می دهد.
شکل ۴-۹٫ هضم دوگانه آنزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK- از سمت راست چاهک اول نمونه هضم انزیمی پلاسمید حاوی ناحیه CD166 و چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1kb –پیکان های قرمز از بالا پلاسمید (bp 2907) و ناحیه CD166 (bp 1558) –پیکان های ابی از بالا محل قرار گیری باند bp 3000 و ۱۵۰۰bp لدر.
۴-۴ ساب کلونینگ ژن CD166
جهت بیان ژن CD166 از باکتری E.coliBL21(DE3) استفاده شد. ابتدا ژن موردنظر از ژل آگارز مرحله الکتروفورز خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد. سپس این ترکیب به سلول های شایسته ای E.Coli BL21 ترانسفورم شد. در شکل ۴-۱۰ نقشه ژنی پلاسمید pet-28a نشان داده شده است.
شکل ۴-۱۰٫ نقشه ژنی پلاسمید pet-28a(www.smapgene.com)
این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد. در شکل ۴-۱۱ کلونی های رشد کرده بر روی محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین بعد از ترانسفورماسیون باکتری BL21(DE3) با پلاسمید pet-28a حاوی ژن CD166 را نشان می دهد.
شکل ۴-۱۱٫ باکتری های BL21(DE3) ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن CD166- از سمت راست چاهک اول ، دوم و سوم نمونه حاوی پلاسمد Pet-28a حاوی ناحیه CD166 و چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1KB .پیکان قرمز باندbp 6957 مربوط به pet حاوی ناحیه CD166 و پیکان ابی محل باندbp 6000 لدر.
سپس از تک کلونی های رشد کرده استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی صورت گرفت تا وجود پلاسمید حاوی ژن موردنظر تائید شده و از طرفی وجود هر گونه آلودگی را از بین می برد. برای تائید وجود پلاسمید pet-28a در محصول استخراج پلاسمید ، الکتروفورز صورت گرفت و با تشکیل باند در ۶۸۳۲ bp ، این ادعا تحقق یافت. در شکل ۴-۱۲ ، نتیجه الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید pet-28a از سلول های ترانسفورم شده BL21(DE3) ، نشان داده شده است.
شکل ۴-۱۲٫ تائید حضور پلاسمید pet-28a حاوی ژن CD166 در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)
پس از این که وجود پلاسمید pet-28a در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن سنتز شده CD166 تائید شد ، به کمک تکنیک هضم دوگانه آنزیمی ، وجود ژن CD166 در پلاسمید ، با توجه به جایگاه های آنزیمی Ncol و Xhol قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. دو باند موردنظر ۱۴۶۳ bp (ژن CD1669 و ۵۳۶۹ bp (پلاسمید pet-28a) نمایان گشت که تائیدی بر وجود ژن موردنظر در باکتری ترانسفورم شده است. شکل ۴-۱۳ ، نتیجه حاصل از هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید pet-28a حاوی ژن CD166 را نشان می دهد.
شکل ۴-۱۳٫ نتیجه حاصل از هضم آنزیمی دوگانه پلاسمید pet-28a حاوی ژن -CD166 چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1kb و چاهک های دوم سوم و چهارم نمونه هضم انزیمی pet حاوی CD166 –پیکان های ابی از بالا باندهای ۶۰۰۰ وbp 1500 لدر و پیکان های قرمز از بالا باند ۵۳۹۶ ((pet28 و هم چنین bp1500 CD166
۴-۵ بیان پروتئین CD166 و تائید آن به کمک تکنیک SDS-page